Utjecaj doze i načina primjene ciklosporina-A na upalne lezije u eksperimentalnom modelu upalne bolesti crijeva : doktorska disertacija - Banić, Marko, liječnik; Rotkvić, Ivo, liječnik; Dekaris, Dragan; Vucelić, Borislav; Šćukanec-Špoljar, Mira; Sikirić, Predrag; Rotkvić, Ivo, liječnik (Zagreb : M. Banić, 1997)
Sažetak: Cilj je ove studije bio istražiti i dokumentirati učinak različitih doza ciklosporina A, primijenjenih intraperitonealno i intrarektalno ( u obliku klizme) na opseg i izraženost upalnih promjena debelog crijeva miševa izazvanih intrarekatlnom primjenom 2,4-dinitrofluorobenzena u prethodno senzibiliziranih miševa. Istraživanje je provedeno na miševima soja NMRI, starim 10-12 tjedana, muškog spola i teškim 30-35 grama. U istraživanje je uključeno ukupno 120 životinja, podijelejnih u skupine od 6-8 miševa, a cjelokupna je studija izvedena u dva dijela. U prvom dijelu istraživanja promatran je učinak intraperitonealno i intrarektalno primjenjenog ciklosporina A (3/5/10/25/50 mg/kg CsA) na opseg upalnih lezija u eksperimentalnom kolitisu, izazvanom primjenom dinitrofluorobenzena.
U eksperimentalnim skupinama tretiranim 3/5/10/25 mg/kg CsA zabilježene su značajno manje upalne promjene kolona, procijenjene histološkim skorom u odnosu na opseg upalnih lezija u kontrolnim skupinama tretiranim intraperitonealnom/intrarektalnom primjenom fiziološke otopine. U skupinama tretiranim intraperitoealnom dozom ciklosporina A od 1 i 50 mg/kg nije zabilježena razlika u odnosu na kontrolnu skupinu što se može tumačiti suboptimalnom (1 mg/kg) ili pak prekomjerno toksičnom (50 mg/kg i. p.) koncentracijom lijeka u punoj krvi pojedine skupine miševa. Eksperimentalne skupine tretirane intraperitonealnom ili intrarektalnom primjenom istih doza CsA nisu se međusobno razlikovale osim kod doze 50 mg/kg kada je u intraperitonealno tretiranoj skupini zabilježen značajno veći opseg lezija koji se nije razlikovao od opsega u kontrolnoj skupini.
U drugom dijelu istraživanja uspoređivan je učinak CsA u odnosu na način primjene (intraperitonealno/intrarektalno) u dozi od 3 mg/kg, koja je prema rezultatima prvog dijela istraživanja nakon intraperitonealne primjene postigla koncentraciju ciklosporina u punoj krvi životinja unutar terapijskog raspona (369 ng/ml) dok nakon intrarektalne primjene nije zabilježena prisutnost lijeka u krvi životinja iz navedene skupine. Vjerodostojan učinak doze od 3 mg/kg CsA primjenjene intraperitonealno i intrarektalno zabilježen je u odnosu na ukupni opseg upalnih lezija kao i u značajno manjem nakupljanju mononuklearnih stanica unutar lamine proprije i submukoze kolona.
Opseg drugih pojedinačno promatranih promjena (ulceracije, nekroze, nakupljanje polimorfonukleara, zahvaćenost seroze upalom) nije se značajno razlikovalo od onoga u netretiranoj kontrolnoj skupini s eksperimentalnim kolitisom. Međusobno se eksperimentalne skupine (3ip 3ir) nisu razlikovale ukupnim opsegom upalnih promjena i pojedinačno promatranim promjenama. Imunohistokemijskom pretragom uzoraka kolona zabilježen je vjerodostojan učinak intraperitonealne i intrarektalne primjene doze od 3 mg/kg CsA u značajno manjoj izraženosti biljega CD25 (IL-2R) na površini mononuklearnih stanica lamine proprije i submukoze debelog crijeva, prema izraženosti CD25 na površini mononuklearnih stanica debelog crijeva netretiranih miševa iz kontrolne skupine s eksperimentalnim kolitisom.
S druge strane, analiza splenocita iz eksperimentalnih i kontrolne skupine te skupine zdravih miševa primjenom protočnog razvrstača stanica nije zabilježila značajne razlike u populacijama stanica s površinskim biljezima CD25, CD(3+25), CD4, CD8, CD3. Učinak intraperitonealno primijenjenog CsA bio je ovisan o koncentraciji ciklosporina u punoj krvi životinja iz određene skupine. Učinak intrarektalno primijenjenog ciklosporina nije ovisio o koncentraciji u krvi te je zabilježen kao vjerodostojan i u skupinama miševa tretiranih dozama 3 i 5 mg/kg CsA i.r. u kojih nije zabilježena značajna prisutnost ciklosporina u krvi. Moguće težište specifičnog i/ili nespecifičnog djelovanja CsA vjerojatno ovisi o dozi, načinu ali i vremenu primjene.
Summary: Cyclosporine (CsA) exerte immunosupressive and antiinflammatory action and is an effective therapeutic option for active, severe ulcerative colitis, although it'may be associated with significant toxicity. The aim of this study was to investigate the effect of CsA, given intraperitonealy (i.p.), or in a form of an enema (i.r.); on inflammatory lesions in haptene-induced murine model of experimental colitis. Experimental colitis was induced in NMRI mice ("PLIVA" Research Institute) using the enema of o.2% solution of dinitrofluorobenzene (DNFB) (Sigma, Saint Louis, USA) in 4:1 acetone to olive oil solution, and combined with previous skin sensitisation.
Experimental groups of animals (N=6-8) were trated with CsA (1;3; 5; 10; 25; 50 mg/kg/day) diluted with phosphate buffered saline (PBS), and given i.p. or i.r., 6 hours after induction of colitis and for consecutive 5 days. Control groups were treated withPBS i.p. or i.r., in the same manner after induction of colitis. On day 5, all the animals were killed and entire colons were taken for histology and pooled whole blood samples of each group of mice was processed with RIA/Mab-S for CsA concentracion. Colonic lesions were assessed using a histopatologic score ranging 0-30. CsA was effective in diminishing the extent of provoked colonic inflammation in experimental groups treated with 3; 5; 10; 25 mg/kg (i.p. and i.r.) and 50 mg/kg (i.r.) (p[0.05, Kruskal-Wallis ANOVA).
In groups treated with 1 mg/kg CsA(i.p. and i.r.) and 50 mg/kg(i.p.) there was no difference, when compared to control groups with maximal observed lesions. Eksperimental groups treated with the same doses of CsA that were proven to be effective (3; 5; 10; 25 mg/kg), did not differ significanty, in regard to way of application (i.p. or i.r.). The comparative effect of 3 mg/kg CsA, applied i.p. (CsA whole blood concentracion 369 ng/mL) or i.r. (CsA not detected in whole blood sample), was investigated in second part of the study. Dose of 3 mg/kg CsA, given i.p. or i.r., significantly diminished the total score of inflammatory colonic lesins, compared to control group with maximal observed lesions (p 0.05).
The significant effect of 3 mg/kg CsA (i.p. or i.r.) was also noted in diminishing the extent of accumulation of mononuclear cells within colonic lamina propria and submucosa (p 0.05). No difference was noted in regard to the way of application (i.p. or i.r.). Immunohistochemical analysis proved the effect of 3 mg/kg CsA (i.p. or i.r.) in diminishing the expression of CD25 on mononuclear cells in lamina propria and submucosa, when compared to CD expression in control group with maximal observed colonic inflammatory lesions (p 0.05). In regard to expression of CD25, CD(3+25), CD4, CD8, CD3; flow - cytometric analysis of splenocyte population did not reveal significant differences between experimental groups, treated wuth 3 mg/kg CsA i.p. or i.r.; and compared to control group with maximal extent of lesions or healthy animals.
In this study, the effect of i.p. application was related to achived concentracions, while the effect of i.r. applicaton was not concentration-related. The effect of antiinflammatory action of CsA is influenced by dose, time and manner of application.
Mentor: Ivo Rotkvić; Komisija za ocjenu: Dragan Dekaris, Boris Vucelić, Mira Šćukanec-Špoljar, Predrag Sikirić, Ivo Rotkvić; Komisija za obranu: Dragan Dekaris, Boris Vucelić, Mira Šćukanec-Špoljar, Predrag Sikirić, Ivo Rotkvić; datum obrane: 12.06.1997.
Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet, Zagreb, 1997
Bibliografija: str. 153-167
Summary
Keywords: Upalne bolesti crijeva -- Imunoterapija; Upalne bolesti crijeva -- Životinjski modeli